Аминокислот в белках, пептидах и лекарственных препаратах

Восстанавливающие растворы. Готовят и фильтруют 3 раствора: 0,01 М 
раствор трифторуксусной кислоты (раствор А); 5 М раствор гуанидина 
гидрохлорида, содержащий 0,01 М трифторуксусной кислоты (раствор В); 
свежеприготовленный раствор диметилформамида, содержащий 36 мг/мл BTI 
(раствор С). 
Методика. Около 200 мкг испытуемого образца помещают в чистую ампулу 
для гидролиза и прибавляют 2 мл раствора А или раствора В и 2 мл раствора С. 
Ампулу для гидролиза герметично запаивают в вакууме. Испытуемый образец 
нагревают при температуре 60 °С в течение 4 ч в защищенном от света месте. 
Затем образец подвергают диализу водой для удаления избытка реактивов. 
Диализированный 
образец 
трижды 
экстрагируют 
равными 
объемами 
бутилацетата и лиофилизируют. Белок может быть затем гидролизован согласно 
описанной ранее методике. Остатки α,β-диаминопропионовой кислоты и α,γ-
диаминомасляной кислоты обычно не отделяются от остатков лизина 
ионообменной хроматографией, используемой при аминокислотном анализе. 
Таким образом, при использовании ионного обмена для разделения при 
аминокислотном анализе содержание аспарагина и глутамина представляет 
собой разницу между количественным содержанием аспарагиновой кислоты и 
глутаминовой кислоты, полученным при кислотном гидролизе без дериватизации 
и с BTI-дериватизацией. Количественное содержание треонина, метионина, 
цистеина, тирозина и гистидина может изменяться при BTI-дериватизации; при 
необходимости определения этих аминокислотных остатков белка/пептида 
следует проводить гидролиз без BTI-дериватизации. 
МЕТОДОЛОГИЯ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА: ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ 
Существует множество способов аминокислотного анализа. Выбор 
конкретного способа зачастую определяется требуемой чувствительностью 
количественного определения. В целом около половины применяемых способов 
аминокислотного анализа основаны на разделении свободных аминокислот 
посредством ионообменной хроматографии с последующей постколоночной 

---

дериватизацией (например, с нингидрином или о-фталевым альдегидом). Методы 
постколоночной дериватизации могут быть использован для образцов, 
содержащих небольшое количество буферных компонентов (таких как соли и 
мочевина) и обычно требует от 5 мкг до 10 мкг испытуемого образца белка для 
проведения одного анализа. Остальные методы аминокислотного анализа обычно 
включают предколоночную дериватизацию свободных аминокислот (например, 
фенилизотиоцианатом; 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбаматом или 
о-фталевым альдегидом; (диметиламино)азобензолсульфонилхлоридом; 9-
фторенилметилхлорформиатом; 
7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом) 
с 
последующим обращенно-фазовым ВЭЖХ анализом. Метод предколоночной 
дериватизации отличается высокой чувствительностью (обычно требуется от 0,5 
мкг до 1,0 мкг испытуемого образца белка для проведения одного анализа), 
однако на него могут оказывать влияние компоненты солевого буфера, 
содержащиеся в испытуемом образце. Предколоночная дериватизация может 
привести к образованию производных одной аминокислоты, что приводит к 
усложнению интерпретации результатов.
Для количественного аминокислотного анализа могут быть использованы 
приведенные ниже методы. Приборы и реактивы для проведения этих испытаний 
коммерчески доступны. Кроме того, многие из этих методов имеют модификации с 
различным приготовлением реактивов, проведением химических реакций, 
различными хроматографическими системами и так далее. Специфические 
параметры могут отличаться в зависимости от конкретного оборудования и 
методики выполнения анализа. Многие лаборатории используют несколько 
методик аминокислотного анализа, так как каждая из них имеет свои 
преимущества. В каждой из этих методик аналоговый сигнал обнаруживается с 
помощью системы сбора данных, а площади пиков используются для 
количественного определения. 
МЕТОД 1. ПОСТКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С НИНГИДРИНОМ 
Ионообменная хроматография с постколоночной дериватизацией с 
нингидрином является одним из наиболее распространенных методов, 
предназначенных для количественного аминокислотного анализа. Как правило, 
для анализа большинства сложных физиологических образцов пригодной 
является катионообменная система на основе ионов лития, а быстрая 
катионообменная система на основе ионов натрия используется для более 
простых смесей аминокислот, полученных при гидролизе белков (обычно 17 
аминокислот). Разделение аминокислот на ионообменной колонке достигается 
подбором рН и ионной силы. Для улучшения разделения часто используют 
температурный градиент.
При взаимодействии аминокислоты с нингидрином образуется продукт с 
характерным фиолетовым или желтым цветом. Аминокислоты, за исключением 
иминокислот, образуют продукт фиолетового цвета, имеющий максимум 
поглощения при 570 нм. Иминокислоты, такие как пролин, образуют продукт 
желтого цвета, имеющий максимум поглощения при 440 нм.
Продукты постколоночной реакции между нингидрином и элюируемыми из 
колонки аминокислотами детектируются при длинах волн 440 нм и 570 нм, а 
полученная хроматограмма используется для определения аминокислотного 
состава.
Предел обнаружения для большинства производных аминокислот обычно 
составляет 10 пмоль, а для производных пролина — 50 пмоль. Линейность 
сигнала наблюдается в области (20—500) пмоль с коэффициентом корреляции 

---

более 0,999. Для получения удовлетворительных данных рекомендуется перед 
гидролизом использовать образцы белка/пептида массой более 1 мкг. 
МЕТОД 2. ПОСТКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С О-ФТАЛЕВЫМ 
АЛЬДЕГИДОМ 
о-Фталевый альдегид (ОФА) реагирует с первичными аминами в 
присутствии тиольных соединений, образуя производные изоиндола с сильной 
флуоресценцией. Эта реакция используется для постколоночной дериватизации 
при аминокислотном анализе методом ионообменной хроматографии. Условия