Asosiy tushunchalar: Restriktaza fermentlari

Restriktaza fermentlari
Restriktaza fermentlari bakteriya (va boshqa prokariotlar) hujayralarida mavjud. Ular DNKning restriktaza saytlari deb nomlangan ketma-ketliklarini taniydi va bogʻlanadi. Har bir restriktaza fermenti faqat bitta yoki bir nechta restriktaza saytlarini taniydi. Ferment nishon ketma-ketligini topganda, DNK molekulasida ikki zanjirli kesma hosil qiladi. Odatda kesish restriktaza saytida yoki uning yaqin qismida boʻladi va tartib bilan, oldindan belgilangan shaklda amalga oshiriladi. 
[Nega bakteriyalar restriktaza fermentlariga ega?]
Restriktaza fermenti DNK ketma-ketligini tanib, uni qanday kesishiga misol tariqasida laboratoriyada keng foydalaniladigan ferment – EcoRI ni koʻrib chiqamiz. EcoRI quyidagi saytlarni kesadi:

5ʼ-...GAATTS...-3ʼ 3ʼ-...STTAAG...-5ʼ
EcoRI sayt
EcoRI ushbu saytni tanib, kesishni har doim aniq bir shaklda bajaradi, natijada bitta zanjirli zinapoyasimon oxirga ega DNK hosil boʻladi:

EcoRI fermenti DNKning bir boʻlagidagi EcoRI saytiga bogʻlanadi va DNKning ikkala zanjirini kesadi. Kesmaning shakli quyidagicha:
5ʼ-...G|AATTS...-3ʼ 3ʼ-...STTAA|G...-5ʼ
Shunday qilib, u kesilgan DNKning har uchida 5ʼ-AATT-3ʼ oxirlarni hosil qiladi.
Agar DNKning boshqa bir boʻlagi mos keluvchi oxirlarga ega boʻlsa (masalan, uni ham EcoRI kesgan boʻlsa), ular komplimentar asoslar juftligi orqali bir-biriga birikib qolishi mumkin. Shu sababli bitta zinapoyasimon oxirlarni hosil qiluvchi fermentlar yopishqoq uchlarni hosil qilib kesuvchi fermentlar deyiladi. Yopishqoq uchlar klonlashda yordam beradi, chunki ular DNK ligazasi bilan bogʻlanishi uchun ikkita DNK boʻlaklarini ushlab turadi.
Restriktaza fermentlarining barchasi ham yopishqoq uchlar hosil qilmaydi. Ayrimlari “toʻmtoq uchlar” hosil qilib, nishon qismining oʻrtasidan kesadi va zinapoyasimon uch hosil qilmaydi. SmaI restriktaza fermenti toʻmtoq uch hosil qilib kesuvchi fermentga misoldir:

SmaI fermenti SmaI restriktaza saytiga bogʻlanadi:
5ʼ-...SSSGGG...-3ʼ 3ʼ-...GGGSSS...5ʼ
Ushbu kesma belgilangan ketma-ketliklarning oʻrtasidan amalga oshiriladi va toʻmtoq uchlar hosil qilinadi. Kesma saytlari:
5ʼ-...SSS|GGG...-3ʼ 3ʼ-...GGG|SSS...5ʼ
Toʻmtoq uchli fragmentlar oʻzaro DNK ligazalar yordamida biriktiriladi. Lekin toʻmtoq uchli fragmentlar qiyin bogʻlanadi (samarasi va natijasi yaxshi chiqish ehtimoli kam), chunki ularda DNK molekulasini ushlab turuvchi zinapoyasimon oxirlar mavjud emas.
[Restriktaza ferment nomlari qanday kelib chiqqan?]
DNK ligaza
DNK replikatsiyasi haqida oʻrgangan boʻlsangiz, demak, DNK ligaza haqida maʼlumotga ega boʻlsangiz kerak. DNK replikatsiyasida ligazaning vazifasi yangi sintezlangan DNK parchalarini birlashtirib, yagona zanjir hosil qilishdan iborat. DNKni klonlashda ishlatiladigan ligazalar ham shu kabi vazifani bajaradi. Agar ikkita DNKning bir-biriga mos keladigan uchlari boʻlsa, unda DNK ligazasi ularni birlashtirib, yaxlit molekula hosil qilishi mumkin.

DNKning 1-fragmenti:
5ʼ-...G 5ʼ-...STTAA
DNKning 2-fragmenti
AATTS...-5ʼ G...-5ʼ
Ikkita molekulaning bir zanjirli qismlari oʻzaro vodorod bogʻlari orqali bogʻlanadi, lekin DNK asosining ayrim qismlarida boʻshliqlar qoladi:
5ʼ-...G|AATTS...-3ʼ 3ʼ-...STTAA|G...-5ʼ
DNK ligaza boʻshliqlarni toʻldirib, yaxlit DNK zanjirini hosil qiladi:
5ʼ-...GAATTS...-3ʼ 3ʼ-...STTAAG...-5ʼ
DNK ligazasi buni qanday amalga oshiradi? Ligaza energiya manbai sifatida ATFdan foydalangan holda reaksiyani katalizlaydi, unda bitta DNK zanjirining 5ʼ uchiga yopishgan fosfat guruhi boshqa zanjirning uchiga yopishgan gidroksil guruhi bilan bogʻlanadi. Ushbu reaksiya yaxlit uglevod-fosfat asosni hosil qiladi.