4-amaliy mashg’ulot. Biologik to’qimalardan genom dnksini ajratish usullari Ishdan maqsad

4-amaliy mashg’ulot. Biologik to’qimalardan genom DNKsini ajratish usullari
Ishdan maqsad: STAB metodi yordamida o’simlik to’qimalaridan genom DNK ajratishni o’rganish.
Kerakli asbob va uskunalar:
-xovoncha yoki probirka (1500-2000 mkl) va stikchalar
-taglik (96 talik)
-sentrifuga
-muzlatgich
-65 ⁰C avtoblot va vorteks
-kontsentrator
-rezina qo’lqop konchiklar (100,200 va 1000 mkl)
Kerakli reagentlar
-suyuq azot
-2x lik STAB
-10x lik STAB
-xloroform:izoamil (24:1)
-STAB precipitation
-High salt RNA ase (50 ml:200 mkl)
-izapropanol
-TE buffer
Ishning mazmuni: Bugungi kunda o’simlik DNK sini ajratish va tozalashning juda ko’plab usullari mavjud va bu usullar yangi tadqiqot ob’yektlariga nisbatan takomillashtirilib, o’zgartirilmoqda. DNK ekstraktsiyasining bir yoki boshqa usulini qo’llash, birinchi navbatda, o’rganilayotgan materialning o’ziga xosligi bilan belgilanadi va ikkinchidan, qanday maqsad bilan amalga oshirilishiga bog’liq: umumiy, yadroviy, xloroplast DNK ni yoki boshqa preparatlarni olish.
Yadroviy DNK, qoida sifatida, eng katta qiziqishdir, chunki u genlarning transkriptsiyasi uchun shablon sifatida xizmat qiladi. DNK ning ekstraktsiyalash usuli nisbatan sodda, yaxshi qayta ishlab chiqilishi va yetarli miqdorda qoniqarli tozalangan DNK preparatlarini tez ishlab chiqarish imkonini berishi kerak. O’simliklardan DNK ni izolyatsiya qilganda, o’simlik materiallarida kam DNK tarkibiga, hujayralarni yo’q qilish qiyinligiga va shuningdek, DNK ni tozalashni qiyinlashtiradigan ko’p miqdorda iflosliklar (polisaxaridlar, pigmentlar, taninlar) bilan bog’liq bir qator metodologik qiyinchiliklarga duch kelinadi.
DNK rentabelligi manba moddasining tabiatiga bog’liq va bu to’qimada DNK ning tarkibi, shuningdek, DNK ni tozalashga xalaqit beruvchi aralashmalar mavjudligi va tabiati bilan belgilanadi. O’simlik DNK rentabelligi odatda hayvonlarning to’qimalariga nisbatan pastroq bo’ladi (masalan, DNK ni yangi barglardan ajratishda 0,1 mg/g barglarga erishish mumkin). Olingan DNK preparatining sifati keyingi ishlarning vazifalari bilan belgilanadi. Har qanday holatda, DNK da preparatlarning spektral xarakteristikalari - A260 / A230 ≥ 2.0, A260 / A280 ≥ 1.8-1.9. PHK ning sof DNK preparatlaridagi tarkibi 2-3 foizdan oshmasligi kerak.
Olingan har qanday DNK mahsuloti tozaligi, o’ziga xosligi va polimerizatsiyasi uchun aniq mezonlarga muvofiq bo’lishi kerak. Mitoxondriyadan va o’simlik hujayralarining plastidlaridan DNK ni juda aniqlik bilan olish uchun yosh to’qimalardan va yuqori o’simliklarning organlaridan (masalan, ko’chatlar) ajratish juda qulaydir. Ba’zi hollarda barglar ko’p miqdordagi eng ko’p ishlatiladigan o’simlik organi hisoblanadi. Shu bilan birga, o’simliklardan yuqori darajada tozalangan DNK preparatlarini olishda ko’rinadigan qiyinchiliklar ham avval barglar bilan ishlaganda uchraydi. Jami DNK ni barglardan ajratganda, bu holda DNK ning bir qismi xloroplast DNK bilan ifodalanishini hisobga olish kerak. Katta yaproqlar yadrodan ko’ra ikki barobar ko’p miqdorda xloroplast DNK ni o’z ichiga oladi. O’rta barglar uchun xloroplast DNK miqdori taxminan yadro DNK si bilan bir xil, kichik yaproqlar uchun DNK ning uchdan bir qismi xloroplastlarda bo’ladi. DNK ni ajratishda muzlatilgan suyuq azot bilan yangi o’simlik materiallaridan ajratib olish afzalroqdir. Muzlatilgan suyuq azot to’qimalari va o’simlik a’zolari ba’zan -20° C da DNK ekstraktsiyasiga qadar saqlanadi.