Amaliy mashg’ulot 9 Mavzu: Sekvenirlash usullari Mashg’ulotning maqsadi

Amaliy mashg’ulot 9
Mavzu: Sekvenirlash usullari
Mashg’ulotning maqsadi: Sekvenirlash usullari bilan tanishtiriladi. Kerakli asbob-uskunalar: DNK shabloni - konsentratsiyasi ma'lum bo'lgan tozalangan DNK preparati - IRDye 700 va/yoki IRDye 800 infraqizil lyuminestsent yorlig'i bilan belgilangan primerlar:Cy5.5 etiketli primerlar (IRDye 700 ga oʻxshash): a) 16S rRNK ketma-ketligi uchun primerlar: 8f-Seq — 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ (zaxira konsentratsiyasi 7.1 pmol/ml, ish konsentratsiyasi 1 pmol/mkl )-Seq -Seq -1492r 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (zaxira konsentratsiyasi - 9,9 pmol/ml, ish konsentratsiyasi - 1 pmol/ml) b) pJET vektoriga primerlarni sekanslash: pJET-F - 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3' (zaxira konsentratsiyasi - 3,2 pmol /µl, ish konsentratsiyasi – 1 pmol/µl) pJET-R — 5′-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3′ (zaxira konsentratsiyasi – 3,7 pmol/ml, ish konsentratsiyasi – 1 pmol/ml) - Reaksiyani ketma-ketlashtirish uchun bufer - DNK polimeraza (sekvenaza) — MilliQ - IR2 Stop Solution (ketma-ketlik reaktsiyasini to'xtatish uchun eritma) - 4 turdagi terminatorlar-dideoksinukleotidlar (ddA, ddC, ddG, ddT) (USB to'plamida) ular binafsha rangli qalpoqli eppendorflarda bo'lib, ddN 7-deaza yoki deyiladi. tegishli Thermo Sequenase® tugatish aralashmasi) - Eppendorf 0,2 ml — Avtomatik pipetkalar 0,2-2 ml, 1-10 ml, 2-20 ml - Muz (qor) - Marker – Kuchaytirgich
Amaliy ishini bajarishda rioya qilinadigan texnika xavfsizlik qoidalari:
Amaliy mashg’ulotlarini bajaruvchi hamma talabalar texnika xavfsizligi bo’yicha yo’riqnoma talablari bilan tanishtirilgan bo’lishlari lozim. Shuningdek talaba o’qituvchi yoki laborantning ruxsatisiz turli moddalarni, asbob-uskunalarni o’zboshimchalik bilan ishlatishi mumkin emas.
Ishning nazariy asoslari.
1) Reagentlarni olib (ketma-ketlikdan tashqari), eritish uchun ularni xona haroratida (yaxshisi qorong'i joyda) qoldiring. Ular erishi bilan ularni muzga / qorga qo'ying.
2) Kerakli miqdordagi eppendorflarni oling, nomerlab qo'ying (nomi yoki namuna raqami + A, C, G yoki T) (shtativ muzda / qorda ham bo'lishi kerak). Eppendorf 5 x namunalar soni bo'lishi kerak (har bir namuna uchun: umumiy PCR aralashmasi uchun 1 eppendorf, har bir dideoksinukleotid uchun 1 eppendorf. Reaksiyalarni ketma-ketlik to'plamini ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq tarqating.
A. DNA Cycle Sequencing Kit (Sequencing with fluorescently labeled primers; Jena Bioscience; cat# PCR-401S, lot# 111.551)) Ependorfga har bir Terminatordan 3 µl (ko‘k qopqoq) qo‘shing (Ada ddA, Cda ddC va hokazo).
2) Har bir namuna uchun umumiy PCR aralashmasini tayyorlang.
Reagentlar va reaktsiyalarning tozaligini diqqat bilan kuzatib boring (maslahatlarni vaqtida o'zgartiring). Aralashmada pufakchalar paydo bo'lishidan saqlaning.
Ushbu tartibda qo'shing: