Bioorganik kimyo

Jihozlar va reaktivlar. Kolonka (220 sm), polietilen yoki rezinadan yasalgan d  0,1-0,2 sm, uzunligi 1-2 m bo`lgan birlashtiruvchi naychalar, DEAE-sellyuloza (sefadeks)-20-40 ml bo`ktirilgan gel’, pH 7,4 bo`lgan natriy fosfat buferi, SF-26, 300 ml tagi yassi kolbalar – 4 dona, 1 l kolba – 1 dona, dializ trubkalari, OZA – 200 mg, OV – 200 mg.

Ishning borishi. Kolonka yuviladi va regeneratsiya (qayta tozalangan) qilib o`z sholatiga keltirilgan anion almashgich ishlash uchun tayyorlangan bufer bilan birga to`ldiriladi (namlash usuli bilan, gel’da pufakchalar shosil bo`lishidan xoli sholda) va tutashtiruvchi naychalar yordamida 100 mg oqsil 10 ml gel’ shisobida oqsil eritmasi solinadi, kolonkani 5 barobar shajmdagi 20 mmol’ natriy fosfat buferi bilan yuviladi. Gel’ bilan bog`langan oqsillar ketma-ket 0,05; 0,1; 0,3 va 0,6 M NaCl tutuvchi buferda elyuatsiya qilinadi. elyuatsiya shar bir bufer bilan elyuatning spektrofotometrdagi A₂₈₀ qiymati nolga teng kelguncha olib boriladi. 0,05 M NaCl dagi elyuat tashlab yuboriladi, 0,1; 0,3 va 0,6 M NaCl dagi elyuatlar dializlanib tarkibini ifodalash uchun foydalaniladi. OZA va TA asosan 0,3 M NaCl bilan elyuatsiya qilinadi va 2 marta 1-2 davomida 20 mmol’ natriy-fosfatli buferga qarshi va 1 marta suvga qarshi dializlanadi. Dializatlar liofillab quritiladi va oqsilni xarakterlash uchun ishlatiladi.

Eslatma. Xromatografik kolonka tayyorlash uchun ko`rgazma: ion - almashinish, affin va gel filtratsion xromatografiya uchun standart kolonkalar yo`q bo`lsa, laboratoriyada tayyorlangan shisha kolonkalardan foydalanish mumkin. Kerakli o`lchamdagi kolonkaga tagidan birlashtiruvchi naycha ulanib taxminan 15 shajmda ishchi bufer quyiladi va naycha berkitiladi. Kolonkaning voronkali quyi qismiga qaynatilgan paxta filtr, uning tepasidan unga mos keladigan filtr qog`oz qo`yiladi va shunday qilib shosil qilingan filtr vaqtincha shisha tayoqcha bilan ushlab turiladi, uncha quyuq bo`lmagan gel’ suspenziyasini asta sekin qo`zgatib yubormasdan kolonkaga quyiladi. 15-30 minutdan so`ng gel’ filtrga cho`kkandan keyin shisha tayoqcha olinadi va kolonkaning pastki naycha qismi ochiladi. Agarda kolonkadagi gelning miqdori kam bo`lsa, suspenziya gel’ cho`kishi bilan yana qo`shiladi. Kolonkaning yuqori qismiga (elyuant quyish uchun) probka yordamida rezina yoki polietilen naycha ulanadi. Ish jarayonida gel’ ustunining qurib qolishiga yo`l qo`yish mumkin emas.