Immunobloting va polimeraz zanjirli reaktsiya

---

16- 
Laboratoriya 
ishi.“IMMUNOBLOTING 
 
VA 
 
POLIMERAZ 
ZANJIRLI 
REAKTSIYA” 
1. Mashg’ulot o’tkazish joyi
- Mikrobiologiya, virusologiya, immunologiya kafedrasi.
 
2. Mashg’ulotning davomiyligi - 45 min. 
3. Mashg’ulotning maqsadi. 
yuqumli kasalliklarga seroloik tashhis qo’yish - Immunobloting va polimeraz zanjirli 
reaksiya usullari bilan tanishtirish. 
 
4. Pedagogik va zifalar: 

yuqumli kasalliklarga seroloik tashhis qo’yishda immunobloting va polimeraz 
zanjirli reaksiya usullarining ahamiyatini tushuntirib berish; 

immunobloting va polimeraz zanjirli reaksiya mohiyati va mexanizimlarini ko’rsatib 
berish.
 
5. O’quv mashg’uloti natijalari 
Talaba bilishi kerak: 

yuqumli kasalliklarga seroloik tashhis qo’yishda immunobloting va polimeraz 
zanjirli reaksiya usullarini ahamiyati haqida ma’lumotga ega bo’lishi; 

immunobloting va polimerazzanjirli reaksiya usullarini mohiyatini, mexanizimlarini 
bilishi; 
 

Talaba qila olishi kerak: 

immunobloting reaksiyasi qo’yish tartiblarini bilish; 

polimeraz zanjirli reaksiyani qo’yish tartiblarini bilish; 
PZRusulining qo’yish texnologiyasi. 
1.
Qon plazmasi, zardobi, orqa miya suyuqligi (OMS) yaxlit periferik qon ertalab nahorgi 
tarkibida 1:20 hisobidan 6% li EDTA eritmasi bo’lgan probirkaga olinadi. Tarkibida 
yaxlit periferik qon tutuvchi berkitilgan probirka bir necha marta ag’dariladi. Plazmani 
olish uchun 
qon tutuvchi probirka 20 daqiqa 
davomida 1600g dastentrifuga qilinadi. 
Qon 
zardo- 
bi standart usuli bilan olinadi. OMS avvaldan qayta ishlash bosqichini o’tmaydi. 
2.
Hayvonlarning ichki a’zolari va sekstion material – ushbu material chinni hovoncha
va dastadan foydalangan holda gomogenlanadi, so’ngra steril fiziologik eritmada yoki 
fosfatli buferda 10 % li suspenziya tayyorlanadi. 
3.
Chivinlardan suspenziya tayyorlash uchun dastlab ularning turi aniqlanadi, «to’plamlar» 
shakllantiriladi (50 ta zotdan ortiq, emas), gomogenlanadi, fiziologik eritma yoki 1 
chivin 
- 
30 
mkl 
hisobidan 
fosfatli 
buferda gomogenlanadi. Sinamalar 10000 aylanish daqiqada stentrifuga qilinadi, 100 
mkl cho’kma usti suyuqligi tanlab olinadi. 
4.
Kanalardan suspenziyalar tayyorlash uchun dastlab ularning turi, to’ydirilganlik 
darajasi aniqlanadi va bunga bog’liq, ravishda kanalarning «to’plamlari» 
shakllantiriladi va suspenziya tayyorlanadi. 
DNK/RNK ekstrakstiyasi quyidagilarni o’zichiga oladi: 
-
Biologik material; 
-
Hujayrali virusli qobiqlarning lizisi; 
-
Nukleoproteid komplekslarning destrukstiyasi; 
-
ekzo va endogennukleazalarning inaktivastiyasi va chiqarib tashlanishi; 
-
PZR ingibitorlarining inaktivastiyasi va chiqarib tashlanishi; 
Ekstrakstiyaning so’nggi mahsuloti - yuqori samarali DNK yoki RNK preparat. 
Polimerazli zanjir reaksiyasi – invitro tarzida DNK – polimeraza fermenti tomonidan 
katalizlanuvchi DNK – nishonlar fragmenti nusxalarining ko’p martalik ortishi. Mazkur usul 
asosida 
DNK 
molekula- 
larining DNK – polimeraza fermenti bilan tabiiy replikastiyasi yotadi. 
DNK tabiiy replikastiyasi bir nechta bosqichdan iborat: 

---

1.
DNK denaturastiyasi (ikkilangan spiralning yechilishi, DNK iplarining tarqalishi); 
2.
DNK qisqa ikki zanjirli qismlarining paydo bo’lishi (DNK sintezining inistiastiyasi uchun 
zarur bo’lgan moddalar); 
3.
DNK yangi zanjirining sintezi (ikkala ipning komplementar tarzda qurib bitkazilishi). 
Zanjirning komplementar tarzda qurib bitkazilishi faqatgina ma’lum startlibloklari – qisqa 
ikkita ipli qismlarda boshlanadi. Bunday bloklarning DNK spestifik uchastkalariga qo’shilishida 
yangi zanjirning sintez jarayonini DNK zanjir bo’ylab emas, balki faqatgina ushbu qismga 
yo’naltirish mumkin bo’ladi. Boshlang’ich bloklarni DNK berilgan qismlarida yaratish uchun 
“praymerlar” 
deb 
nomlanuvchi 
ikkita 
oligonukleotid 
qo’llaniladi. 
Praymerlar 
spestifikfragmentning chap va o’ng chegaralarida DNK ketma – ketligiga komplementar bo’lib, 
DNK 
yangi 
zanjirining 
qurib 
bitkazilishi 
faqatgina 
ularning 
orasida 
kechishiga 
yo’naltirilgan bo’ladi. DNK izlanayotgan fragmentini yetarli miqdorda olish uchun 
amplifikastiya bir nechta (20 - 40) stikllarni o’z ichiga oladi. 
Amplifikastiyani o’tkazish uchun quyidagi komplementlar zarur bo’ladi: 
1.
Tarkibida izlanayotgan spestifik fragmentni tutuvchi DNK boshlang’ich molekulasi 
(matrista). 
2.
Aniqlanayotgan spestifik fragmentning chegaralarida DNK ketma-ketligiga 
komplementar bo’lgan praymerlar (20 - 30 nukleotid juftliklarning sintetik 
oligonukleotidlari). 
3.
Dezoksinukleotid trifosfatlar (DNTF – DNK yangi komplementar zanjirining 
sintezi uchun material bo’luvchi to’rtta DNTF aralashmasi). 
4.
Taq-polimeraza fermenti (sintezlanuvchi DNK o’sib boruvchi zanjiriga ketma-ket 
birikishi yo’li bilan praymerlar zanjirlarining uzayishini katalizlovchi 
termobarqaror DNK-polimeraza); 
Buferli eritma (fermentning faolligini ushlab turish uchun zarur bo’lgan Mg
2+ 
ionlarini 
tutuvchi reakstion muhit). 
Amplifikastiyaning Har bir sikli o’z ichiga turli harorat tartibida kechadigan 3 ta 
bosqichnioladi: 
1-
bosqich - DNK denaturastiyasi (ikkilangan spiralning bo’shatilishi). 93°- 95°Cda 30 - 
40 soniya davomida kechadi. 
2-
bosqich - praymerlarning birikishi (yumshatish).Spestifik qismning chegaralarida 
DNK zanjirlarining qarama – qarshi zanjirlarida mos keluvchi ketma- ketlikka komplementar 
tarzda kechadi. Praymerlarning Har bir juftligi uchun yumshatishning o’z harorati mavjud bo’lib,
uning ahamiyati 50-65°C oralig’ida joylashadi. Yumshatish vaqti 20-60 soniya. 
3-
bosqich - DNK zanjirlarining qurib bitkazilishi. DNK zanjirlarining komplementar 
tarzda qurib bitkazilishi praymerlarning qo’shilish uchastkalaridan boshlanib, zanjirning 5-
oxiridan 3-oxirigacha ro’y beradi. DNK yangi zanjirlari sintezi uchun material sifatida eritmaga 
qo’shiladigan dezoksiribonukleotidtrifosfatlar (DNTF) xizmat qiladi. Sintez jarayoni DNK – 
polimerazaning 
termostabil 
fermenti 
tomoni- 
dan katalizlanadi(Taq-polimeraza) va 70-72°C haroratda kechadi. Sintezning kechish vaqti - 
20-40 soniya. 
Amplifikastiyaning Birinchi siklida hosil bo’lgan DNK yangi zanjirlari amplifikastiyaning 
ikkinchi sikli uchun matrista bo’lib xizmat qilib, unda DNK izlanayotgan spetsifik 
fragmentining (amplikonning) paydo bo’lishi ro’y beradi. Amplikastiyaning keyingi sikllarida 
amplikonlar yangi zanjirlarning sintezi uchun matrista bo’lib xizmat qiladi. Shunday qilib, 
eritmada 2 pformulasi bo’yicha amplikonlarning to’planishi ro’y berib, bu yerda amplifikastiya 
sikllarining soni. Shuning uchun agar boshlang’ich eritmada DNK molekulasining faqat 
bittagina ikki zanjirli molekulasi bo’lgan bo’lsa, 30 -40 sikllar orasida amplikonlarning 108 ga 
yaqin molekulasi to’planadi. Bu miqdor ishonchli tarzdagi detekstiya uchun yetarli hisoblanadi. 

---

58-rasm. PZR ning qo’yish sxemasi. dDNK –dezoksinukleotidtrifosfat 
PZR – PZR tarkibida RNK tutuvchi biologik materialning tekshirilishi quyidagi 
bosqichlardan iborat: 
- tekshirilayotgan namunalardan RNK ekstrakstiyasini o’tkazish; 
-
«real vaqt» tartibidagi bridizastion flyuoresstentli detekstiya bilan teskari 
transkripstiya va amplifikastiyani o’tkazish; 
-
Natijalarni tahlil qilish va izohlash. 
PZR o’tkazish uchun tahlilning turli bosqichlarini hududiy jihatdan ajratish zarur bo’lib, 
ular alohida xonalarga joylashtiriladi. Laboratoriyadagi faoliyat bir tomonlama (ketma - 
ketlik), PZR oldingi xonalardan PZR - xonalariga qarab tashkil etilishi kerak. 

Biologik materialni qabul qilish, ro’yxatga olish va birlamchi qayta ishlov berish xonasi.

DNK/RNK ajratib olish, PZR uchun reakstion aralashmani tayyorlash, PZR uchun 
reakstion aralashma va namunalarni probirkalarga aralashtirish (ushbu ishlarni turli 
laminar bokslarda o’tkazish kerak) uchun PZR – oldingi xona. 

Mahsulotlarni detekstiyalash o’tkaziladigan PZR -xona. Ushbu xonada infekstiyani 
detekstiya qilishning boshqa usullariga ham yo’l qo’yiladi. 
PZR klassik usuli (gel-elektroforez) qo’llanilganda qo’shimcha xonalar talab qilinadi. 
Biologik materiallarni qayta ishlash xonasi va reakstion aralashmani tayyorlash xonasida 
ultrabinafsha lampali yoki laminarli stolustibokslari o’rnatilgan bo’lishi lozim. 
PZR - tashxis qo’yish laboratoriyasi faqatgina ushbu xonada qo’llaniladigan o’zining 
reagent to’plamlari, avtomatik pipetkalar (dozatorlar), uchliklar, plastik va shishali idishlar, 
laboratoriya jihozlari, xalatlar va qo’lqoplarga ega bo’lishi kerak. 
Har bir xonadagi jihozlar, materiallar va ashyolar mos keluvchi belgiga ega bo’lib, ularni 
boshqa xonalarga olib chiqilishi taqiqlanadi. 
Ish olib borishga oliy va o’rta maxsus ma’lumotga ega bo’lgan, tashxis qo’yishning 
molekulyar – genetik usullar (PZR) bo’yicha maxsus kurslarda o’qigan, hamda biologik 
xavfsizlik bo’yicha tayyorgarlik o’tgan shaxslar qo’yiladi.