Termiz davlat universteti tabiiy fanlar fakulteti

Sanger boʻyicha sekvenirlash usuli

Sekvenirlanishi kerak boʻlgan DNK namunasi probirkada praymer, DNK polimeraza va nukleotidlar (dATF, dTTF, dGTF va dSTF) bilan aralashtiriladi. Toʻrtta boʻyalib nishonlangan zanjir terminatsiyalovchi dideoksi nukleotidlar ham qoʻshiladi, lekin oddiy nukleotidlarga qaraganda kamroq miqdorda.
Dastlab andoza DNKni denaturatsiyalash (zanjirlarini ajratish) uchun aralashma qizdiriladi, keyin esa praymer bir zanjirli andozaga bogʻlanishi uchun sovitiladi. Praymer bogʻlangach, harorat yana oshiriladi, bu DNK polimerazaga praymerdan boshlab yangi DNK zanjiri sintezlashi uchun sharoit yaratadi. DNK polimeraza zanjirga nukleotid biriktirishni boshlaydi, bu holat normal nukleotid oʻrniga dideoksi nukleotidni zanjirga biriktirguncha davom etadi. Shu nuqtada boshqa nukleotidlar qoʻshilmaydi, shuning uchun zanjir dideoksi nukleotid bilan tugaydi.
Bu jarayon bir nechta sikl davom etadi. Sikl tugagandan soʻng kamida bitta reaksiya davomida nishon DNKning har biriga dideoksi nukleotidi qoʻshilishi deyarli kafolatlanadi. Reaksiya oxirida, probirkada har birining tarkibida boshlangʻich DNKdagi nukleotidlarga ega boʻlgan turli uzunlikdagi fragmentlar boʻladi (quyidagi rasmga qarang). Fragmentlarning oxirgi uchlari soʻnggi nukleotidni koʻrsatuvchi boʻyoqlar bilan yorliqlangan.
Rasm “Sanger boʻyicha sekvenirlash”, Estevezj (CC BY-SA 3.0). Rasm (CC BY-SA 3.0) ruxsatnomasi asosida takomillashtirildi.
Reaksiya tugagach fragmentlar oʻzida gel saqlagan uzun va ingichka nay boʻylab harakatlana boshlaydi, bu jarayon kapillyar gel elektroforezi deb nomlanadi. Qisqa fragmentlar geldagi poralar orqali tez harakatlanadi, uzunlari esa sekinroq harakatlanadi. Har bir fragment probirka oxiridagi “finish” chizigʻini bosib oʻtgandan soʻng, boʻyoqni aniqlashga yordam beruvchi lazer nuri bilan yoritiladi.
Eng kichik fragment (praymerdan keyin bitta nukleotid bilan tugaydigan) finish chizigʻini birinchi bosib oʻtadi, ikkinchi boʻlib undan kattarogʻi (praymerdan keyin ikkita nukleotid bilan tugaydigan) bosib oʻtadi va shu tariqa davom etadi. Shunday qilib, boʻyoq ranglari birin-ketin detektor (aniqlagich)ga yozib olinadi, boshlangʻich DNK boʻlagining ketma-ketligi maʼlum vaqt ichida tiklanadi. Detektor tomonidan yozib olingan maʼlumotlar yuqoridagi xromatogrammada koʻrsatilganidek, fluoressent nurlarining yuqori nuqtaga chiqishini oʻz ichiga oladi. Xromatogrammadagi DNK ketma-ketliklari shu yuqori nuqtalar orqali oʻqiladi.