Termiz davlat universteti tabiiy fanlar fakulteti

2. Bisulfit sekvenslash mexanizmi
DNK ekstrakti protsedurasi keng qo'llaniladi va ko'pincha genetik muhandislik va molekulyar genetik tadqiqotlarning boshlanish nuqtasidir. CTAB detarjenidan foydalangan holda DNKni ajratib olish usuli Merrey va Tompson (1980) uslubining modifikatsiyasi bo'lib, u katta miqdordagi materialni skrining qilishda analitik izolyatsiya qilishda va o'simlik materialidan genomik DNKni izolyatsiyalashda ishlatilishi mumkin.
O'simliklar DNKini ajratish tartibi bir necha bosqichlardan iborat: hujayra lizisi, RNKning yo'q qilinishi, deprotizatsiya va organik moddalar (xloroform) yordamida DNK ekstraktsiyasi va etanol yoki izoprapanol yordamida nuklein kislotalarning oxirgi yog'inlari (DNK spirtli eritma bilan eritmada huzurida cho'ktiriladi) natriy ionlari, yoki lityum yoki ammoniyning yuqori konsentratsiyasi). Hujayra devorlarini yo'q qilish uchun o'simlik barglari bir-ikki daqiqagacha Eppendorf trubkasida DNK ekstrakti uchun CTAB Buferi ishtirokida sayqallangan shisha pestle bilan yaxshilab maydalanadi (1-ilovaga qarang). Tamponning bir qismi bo'lgan Tris eritmaning kerakli pH qiymatini ta'minlaydi (DNK pH qiymati 7,0 dan 8,5 gacha eng barqaror). EDTA magniy va kaltsiy ionlarini eritmadagi biriktirish uchun xelatlovchi vosita sifatida ishlatiladi.
Ekstraktsiya tamponida hujayra membranalarini samarali ravishda yo'q qiladigan katyonik yuvish vositasi bo'lgan CTAB mavjud va NaCl (1M) yuqori konsentratsiyasida nuklein kislotalar eriydi va eritmadan oqsillar va polisaxaridlar cho'ktiriladi. Xloroform bilan ekstraktsiyadan so'ng, polisabaridlar va oqsillar bilan STAB kompleksi interfazada va organik fazada paydo bo'ladi. Proteinlarni cho'ktirish va DNK-STAB kompleksini eritish uchun ekstraktsiya tamponiga 1,4 M NaCl qo'shiladi. Bundan tashqari, RNase A ekstraktsiya tamponiga ishlatilishidan oldin qo'shiladi.Hujayrali RNKni olib tashlash, PCR namunalarini kelgusida ishlatish uchun zarurdir. RNaseA 37 ° C da uyali RNKni samarali ravishda buzadi; shuning uchun xloroform bilan DNK ekstraktsiyasidan oldin namunalarni 37 ° C da oldindan inkubatsiya qilish maqsadga muvofiqdir.
Eritmadan DNK olish uchun xloroform va izoamil spirt (24: 1) aralashmasi ishlatiladi. Isoamil spirti saqlash paytida xloroformning ko'piklanishini va oksidlanishini pasaytiradi.
DNKning cho'kishi teng miqdordagi izopropil spirt bilan xona haroratida amalga oshiriladi (1-ilovaga qarang). Polisaxaridlar va pigmentlarning DNK bilan yog'inlanishiga yo'l qo'ymaslik uchun DNKni cho'ktirish jarayoni tezda bajarilishi kerak. Qoldiq ekstraktsiya tamponi, izopropanol va xloroformni olib tashlash uchun DNK pelletini 70% etanol bilan yaxshilab yuvish kerak.
Protokol:
1. 100 mg yangi barglar yoki o'simliklarning ko'chatlari (yoki ammoniy sulfat asosida saqlash uchun RNAlater eritmasida saqlangan material, 1-ilovaga qarang) 1,5 ml Eppendorf trubkasida DNK ekstrakti uchun 500 ml CTAB buferi bilan maydalang, 1 ll qo'shing. RNase A (10 mg / ml), vorteks va 55-60 ° C da 30-60 daqiqa davomida inkübe qiling. Bundan tashqari, 37 ° C da 10-15 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, shunda RNase A genomik RNKni yo'q qiladi.
2. Sinov naychasiga teng miqdordagi xloroform aralashmasidan (500-600 mkl) qo'shing: izoamil spirt (25: 1), yaxshilab girdoblang (iloji boricha DNKni oqsillardan ajratib olish muhimdir) va 14000 da santrifüj qiling rpm 5 min (organik va suvli fazalarni ajratish).
3. Yuqori suvli fraktsiyani teng miqdordagi (600 µl) sovuq izopropanol (+ 4 ° C) va girdobni o'z ichiga olgan toza 1,5 ml naychaga o'tkazing (spirt eritmasidan DNKni yaxshilab aralashtirib cho'kadi).
4. DNK 14000 rpmda 5 minut davomida santrifüj bilan cho'kadi; ustki qavatni ehtiyotkorlik bilan to'kib tashlang.
5. DNK cho`kmasi bilan probirkaga 1 ml 70% etanol soling, cho`kmaning spirtda suzishini ta'minlash uchun yaxshilab girdoblang. Santrifüjni 5 minut davomida 14000 rpmda takrorlang; ustki qavatni ehtiyotkorlik bilan to'kib tashlang (cho'kma 70% etanolda yuvilgandan keyin kolba tubida kam saqlanadi).
6. DNK cho'kmasini quritmang va darhol 200-500 ul 1xTE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 1mM EDTA) da 55 ° S da, vaqti-vaqti bilan aralashtirib, 10-20 daqiqa davomida eritib oling. Qoida tariqasida DNK cho'kmasi darhol 1xTE eritmasi yuzasiga suzadi va eriydi. DNKni -20 ° S haroratda saqlang (uzoq muddatli saqlash) yoki + 4 ° S (tez-tez ishlatib).
7. VersaFluor fluorimetry yoki Smartspec Plus kyuvet spektrofotometri yordamida DNK kontsentratsiyasini aniqlang. NanoDrop® ND-1000 UV-Vis spektrofotometri yordamida DNK kontsentratsiyasini aniqlashni http://www.nanodrop.com saytida topish mumkin.
8. Yangi mikrotubkalardagi DNK zahirasidagi eritmani 10 ng / mL konsentratsiyasida suyultirib, 4 ° C da saqlang. DNK zaxirasini -20 ° C da saqlang.
BioSan UV-Cleaner box-1200 PCR qutisiga yoki laminar oqim ostida steril sharoitda inkubatsiya aralashmasini tayyorlang. Reaktsiya aralashmasini tuzish uchun 0,6 ml Eppendorf naychalarini ishlating.
Reaktivlar:
1. "MilliyQ" deionizatsiyalangan suv;
2.10xb
25 mM MgCl2 o'z ichiga olgan PCR tampon (ishlab chiqaruvchi tomonidan Taq polimeraza bilan ta'minlangan);
3. 10 mM dNTPs eritmasi (deoksinukleotid trifosfatlar) (har bir dATP, dGTP, dCTP, dTTP ning 10 mM aralashmasi);
4. RAPD primerlari;
5. Taq-polimeraza eritmasi (ml uchun 5 birlik);
6. Mineral moy (faqat "Tertsik MS-2 +" da kuchaytirish uchun);
7. Shablon DNK namunasi (konsentratsiyasi 10 ng / ml);
PCR buferi (10x) quyidagi tarkibiy qismlarni o'z ichiga oladi: 100 mM Tris-HCl (pH 9.0); 500 mm KCl; 1% Triton X-100 va 25 mM MgCl2. Harorat ko'tarilganda Tris tamponining pH qiymati pasayishi (harorat koeffitsienti ~ -0,031 pH birliklari / ° C) va 72 ° C da ~ 7,5 ga teng bo'lishi sababli yuqori pH qiymati zarur. Taq polimerazasining optimal konsentratsiyasi reaksiya aralashmasining 20 ml ga 1 birlik ferment hisoblanadi. Triton X-100 - naycha yuzasida polimeraza adsorbsiyasini oldini oladi. MgCl2 ning ishchi kontsentratsiyasi oralig'i 1,5 dan 5,0 mm gacha. Mg2 + kontsentratsiyasining oshishi bilan kuchayish samaradorligi oshadi, ammo reaktsiyaning o'ziga xos xususiyati pasayishi mumkin. DNTP kontsentratsiyasining diapazoni 100 - 500 mM (200 mkM eng maqbul kontsentratsiya). PCR uchun RAPD primerining ishlatilgan konsentratsiyasi diapazoni: 0,2-1,0 µM.
Protokol:
1. Master-Mix tayyorlang. Eksperimentni tashkil qilishda DNK va primerdan tashqari barcha kerakli komponentlarni o'z ichiga olgan PCR ("Master-mix") uchun umumiy reaksiya aralashmasini tayyorlash kerak. Buning uchun barcha namunalar va yana bir nechta namunalar uchun reaktsiya aralashmasining umumiy hajmini hisoblang. Masalan, 8 ta namunani kuchaytirish uchun 25 µl yakuniy hajm uchun 10 ta namuna uchun aralashma tayyorlang, u 250 µl (suvdan Taq polimerazigacha ketma-ketlikda) bo'ladi.
2. Steril va imzolangan 0,5 ml naychaga PCR uchun 21 ml "Master-Mix" qo'shing;
3. 1xTE eritmasida 10 mkM konsentratsiyali primerlarni oldindan tayyorlash kerak. Buni qo'lda yoki jadvalda topish mumkin. 2: bitta reaktsiya uchun har bir primerning kerakli hajmi "Vpr =" ustunida; bundan tashqari, "Tm" ustunida ma'lum bir primer uchun talab qilinadigan tavlanish haroratini topishingiz mumkin.
4. Har bir namuna uchun 0,6 µM yakuniy konsentratsiyasida 1,5 µL 10 µM RAPD astar qo'shing;
5. 1 ta reaksiya uchun 0,8 mkl (2 akt. Birlik) tezligida Tag-polimeraza qo'shing;
6. Probirkaga DNKning 2,5 ul (10ng / ul) namunasini qo'shing, reaksiya aralashmasidagi DNKning yakuniy konsentratsiyasi 1 ng / ul;
7. Tertsik MC2 + kuchaytirgichida amplifikatsiyani o'tkazishda reaksiya aralashmasi ustiga 2 tomchi mineral moy soling, bu esa kuchaytirganda qizdirilganda aralashmani bug'lanishdan saqlaydi;
8. Aralashmani muloyimlik bilan vortekslang;
9. Tarkibni naychalarning pastki qismiga to'kib tashlang (2400 rpm da 5 soniya davomida santrifüj);
10. Naychalarni termosikler qurilmasiga nosimmetrik yo'nalishda joylashtiring, jihoz qopqog'ini mahkam yoping;
11. Kuchaytirish dasturini buyruqlar ketma-ketligi bilan boshlang: , ,
, <25 µl>.
12. Kuchaytirish tugagandan so'ng, buyrug'ini bajaring.
Har bir namuna uchun primerlar sonini va namunalar sonini kiritganingizda, reaktivlarning umumiy miqdori avtomatik ravishda hisoblab chiqiladi (barcha hajmlar ml bilan ko'rsatilgan). Chop etilgan jadval reaktsiya jarayoni va natijasini tavsiflovchi hujjat sifatida ishlatilishi mumkin.
Kuchaytirishni quyidagi dasturga muvofiq Tertsik yoki MJ MiniCycler termosiklerida bajaring:
1. Denaturatsiyadan oldin - 94 ° C, 4 min;
2. O'ttiz beshta tsikl: 1) 95 ° C, 15 sek; 2) 37 ° C, 1 min; 3) 70 ° C, 2 min;
3. Oxirgi cho'zish: 72 ° C, 5 min.
Amplifikatsiya tugagandan so'ng agarozli gelda DNKning elektroforezi.
DNK agaroza gel elektroforezi
1. Kerakli miqdorda agarozni torting. Agaroza miqdori quyidagi formula bo'yicha hisoblanadi:
m = V * C / 100%, bu erda m - agarozaning grammdagi massasi, V - jelning mldagi hajmi, C - agarozaning foizda konsentratsiyasi.
2. Agarozani 250 ml issiqlikka bardoshli shisha idishga soling va kerakli miqdordagi 1x TBE (yoki 1x STBE) bufer bilan to'ldiring.
3. Kerakli etidiy bromid hajmini qo'shing (gelga qo'shilgan etidiy bromid hajmi gel miqdorining 1/10 qismiga teng (ml))). Qo'lqopli etidiy bromidi bilan ishlang, naychani ochishdan oldin uning tarkibini santrifüj bilan 3 soniya davomida muloyimlik bilan silkitib oling. 2400 rpmda.
4. Jel qolipini tayyorlang va tayyorlangan qolipni gorizontal ravishda stol ustiga qo'ying. 5. Taroqni qolipning pastki qismidan taroq tishlariga qadar bo'lgan masofa 2 - 3 mm bo'lishi uchun teshiklarni joylashtiring, tashqi tishlar qolipning yon devorlariga tegmasligi kerak. Taroq qolipning uchlariga parallel bo'lishi kerak.
6. Agarozni mikroto'lqinli pechda muntazam aralashtirish bilan to'liq eritmaguncha qizdiring. Qaynatgandan so'ng (katta pufakchalar paydo bo'lguncha kuting), kolbani olib tashlang va 55 ° - 60 ° C gacha soviting. Aralashga etidiy bromid qo'shing, yaxshilab aralashtiring va uni jel qolipiga quying. Taroqlarning holatini tekshiring va jelni 20-30 daqiqaga qoldiring.
7. Amplifikatsiya aralashmasi bilan naychalarga 1 tomchi glitserin qo'shing, aralashmani yaxshilab vortekslang va naychalarni 5 sek. Santrifüj qiling. 2400 rpmda. Naychalarni mos ravishda joylashtiringnamunalarni qo'llash tartibi bilan. Jel to'liq qotib bo'lgandan keyin uni 1 baravar TBE tampon bilan to'ldiring va ehtiyotkorlik bilan taroqlarni tortib oling. Tamponni tashlang va alohida mikropipetka bilan jelga namunalarni (har biri 10 ul) va molekulyar og'irlik markerini (6 ul) qo'llang.
8. Jelni elektroforez kamerasiga ehtiyotkorlik bilan joylashtiring, kamera qopqog'ini yoping, oqim manbasini yoqing va 5 V / sm elektroforez o'tkazing.
9. Elektroforezni 2 soat davomida bajarish kerak, chiziqlar aniq ko'rinadiganligiga ishonch hosil qiling, tokni o'chiring, kamera qopqog'ini echib oling va jelni qolipdan oling (qo'lqop bilan ishlang).

3. Genom DNKni bisulfit ishlashning zamonaviy texnologiyasi

Genomik DNKning ekstraktsiyasi va tahlili.
Molekulyar tadqiqotlar uchun standart fenol-xloroform ekstraktsiyasi usuli bilan to'liq qon va qattiq to'qima namunalaridan ajratilgan genomik DNK (Johns M.B. Jr., Paulus-Thomas J.E., 1989) edi. Natriy bisulfit va keyinchalik metilga xos PCR bilan DNK bilan davolash mustaqil ravishda ishlab chiqilgan va ro'yxatdan o'tgan DNK texnologiyasiga muvofiq amalga oshirildi (Strelnikov V.V. va boshq., FS ruxsatnomasi 2011/134, 27.05.2011 y.). DNKning gidrolizini restriksion endonukleazalar va DNK bo'laklarini bog'lash fermentlar ishlab chiqaruvchisi (Sibenzim, Rossiya) protokollariga muvofiq amalga oshirildi. Metilga sezgir PCR muallif tomonidan ishlab chiqilgan sxema bo'yicha amalga oshirildi (Strelnikov V.V. va boshq., 1999). Imprintlangan genlarning metilatsiyasini tahlil qilish uchun biz o'zimizning DNK texnologiyasidan foydalanganmiz (Nemtsova M.V., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V., FSning 2011/131 yildagi 27.02.2011 yildagi qarori). DNKni sekvensiyalash va fragmentlarni tahlil qilish uskunalar va reaktivlar ishlab chiqaruvchisi (Applied Biosystems, AQSh) protokollariga muvofiq amalga oshirildi. DNKning metilatsiyasini differentsial skrining protokollari Rossiya Tibbiyot fanlari akademiyasining Moskva davlat ilmiy markazi Epigenetika laboratoriyasi xodimlari bilan hamkorlikda mustaqil ravishda ishlab chiqilgan (Kuznetsova va boshq., 2004; Strelnikov va boshq., 2009).
Eksperimentlar natijalarini rejalashtirish va tahlil qilish uchun dasturiy ta'minot.
PCR uchun oligonukleotid primerlarini loyihalashtirish OLIGO (Rychlik and Rhoads, 1989), Methprimer (Li, Dahiya, 2002), Methyl Primer Express (Applied Biosystems, AQSh) dasturlari yordamida amalga oshirildi. Kapillyar elektroforezning elektroforezlarini vizualizatsiya qilish va tahlil qilish PeakPick va AIMS mustaqil ravishda ishlab chiqilgan va ro'yxatdan o'tgan kompyuter dasturlari tomonidan taqdim etilgan (Tanas A.S., Rudenko V.V., Strelnikov V.V.; VNTIC ro'yxatga olish raqamlari 2010 yildan 50201050040 va 2011 yildan 50201151514). Tajribalar rejalashtirildi va metilomani namoyish qilish AIMS-ni siliko dasturida qo'llash bilan tavsiflandi.
III. Natija va uning munozarasi.
Tadqiqot natijasida DNKning differentsial metilatsiyasini skrining qilishning o'ziga xos metodikasi ishlab chiqildi, yangi usullar ko'krak bezi saratoni (miloddan avvalgi) hujayra liniyalari materialida muvaffaqiyatli sinovdan o'tkazildi, undan keyin BC metilomalari, buyrak saratoni (RP), siydik pufagi saratoni (BC) va mayda bo'lmagan hujayra saratoni tahlil qilindi, o'pka (NSCLC), B hujayrali o'tkir limfoblastik leykemiya (B-ALL), normal periferik qon limfotsitlari va bukkal epiteliya va xarakterli metotiplar, shuningdek yangi o'rganilayotgan materiallarda differentsial va doimiy ravishda metillangan genlar va lokuslar. Xromatinning mahalliy xususiyatlariga qarab normal sharoitda va kanserogenezda DNK mintaqalarining metilatsiya holatini tahlil qilish amalga oshirildi va ushbu xususiyatlarni bog'laydigan gipoteza taklif qilindi.
Olingan natijalarga asoslanib, genomning salomatlikdagi va malign transformatsiyalar paytida mahalliy xususiyatlaridan kelib chiqqan holda, kanserogenezda ishtirok etgan nomzod gen hududlarini differentsial metilatsiyasini tahlil qilish uchun tanlovga sintetik yondashuv shakllandi. Tadqiqotning yakuniy bosqichida ishlab chiqilgan sintetik yondashuv kanserogenezda ishtirok etgan genlar oilasi (laminin subbirliklarining genlari) modelida sinovdan o'tkazildi, bu usulning yuqori bashorat qilish potentsialini namoyish etdi.
Genomlarning differentsial metilatsiyasini o'rganish sohasida biz bir tomonlama va xolis skrining metodologiyasini ishlab chiqdik. Qarama-qarshi yondashuvlar ushbu lokuslarning differentsial metilatsiyasini aniqlanishini bashorat qiladigan u yoki bu gipotezaga asoslangan tadqiqot uchun lokuslarni tanlashni nazarda tutadi. Boshqa tomondan, xolis skrining, ilgari noma'lum bo'lgan genomik joylarni differentsial metilatsiyasini aniqlashni o'z ichiga oladi, keyinchalik ularning nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash. Xolis skrining genomik mintaqalarning differentsial metilatsiyasini samarali ravishda aniqlaydi, ular epigenomalar to'g'risida etarli ma'lumotga ega emasligi sababli, ma'lum farazlarga bo'ysunmaydi va birinchi guruh usullari bo'yicha tahlilga kiritilmaydi (Fraga M.F., Esteller M., 2002).
MPFP usulini optimallashtirish
MPFP usuli boshqa mualliflardan mustaqil ravishda ishlab chiqilgan (eng qadimgi analogi MS-AP-PCR, metilatsiyaga sezgir o'zboshimchalik bilan astarlangan PCR, Gonzalgo M.L. va boshq., 1997). Tavsiya etilgan versiya "klassik" versiyasidan farq qiladi va keyinchalik nashr etilganligi sababli (Drozd OV, Strelnikov V.V., Nemtsova M.V., Zaletaev DV, 2002), u "optimallashtirilgan MPP usuli" deb nomlangan.
MPPP - turli genomlardagi differentsial metillangan CpG orollarini tasavvur qilishning eng aniq usullaridan biri. Usulning sxematik diagrammasi shakl. bitta.

Anjir. 1. MPFP usulining sxemasi. Moviy rang genomik DNKning S, G ga boy mintaqalarini, to'q sariq - primerlarni bildiradi. Pastki o'ng tomon - MPPP mahsulotlarini jelda kumush nitrat bilan bo'yash orqali ingl. 1, 2, 3 - miloddan avvalgi namunalar, M - molekulyar og'irlik markeri; o'q taqdim etilgan namunalarda differentsial ravishda metillangan bo'lakni ko'rsatadi.

Tahlil qilish uchun DNK namunalari bosqichma-bosqich gidrolizga uchraydi. Birinchi bosqichda namunalarni CpG orollari fraktsiyasi bilan yanada kuchaytirish va boyitish uchun bo'laklarning hajmini kamaytirish uchun DNK RsaI bilan gidrolizlanadi, uning tanib olinadigan joyida C va G nukleotidlari mavjud emas. Olingan cheklovning alikotlari CCGG tanib olish joyiga ega bo'lgan HpaII va MspI metilatsiyasiga sezgir va befarq bo'lgan gidroliz bilan parallel gidrolizga uchraydi.
Degenerat C, G ga boy astarlar bilan polimeraza zanjiri reaktsiyasi RsaI, RsaI + MspI, RsaI + HpaII cheklash guruhlarining har biri uchun yumshoq sharoitda (past tavlanish harorati) amalga oshiriladi. RsaI cheklovini kuchaytirish natijasida CG ga boy fragmentlar havzasi hosil bo'ladi. RsaI va metilatsiyaga befarq bo'lgan MspI fermenti bilan ishlangan namunalarni kuchaytirish CCGG tanib olish joyi mavjudligini aniqlashga imkon beradi, bu erda shablon primerlar bilan PCR mahsuloti o'rtasida uzilib qolmaydi. Va nihoyat, RsaI + HpaII cheklovining kuchayishi DNK fragmentining metillanish holatini tahlil qilishga imkon beradi. Agar tanib olish joyidagi ichki CpG dinukleotidi metillanmagan bo'lsa, fragment metilga sezgir restriksiya fermenti bilan gidrolizlanadi va PCR mahsuloti yo'q. Saytni metilatsiyalash holatida shablon buzilmagan bo'lib qoladi va kuchaytiruvchi mahsulot jelda aniqlanadi (Gonzalgo M.L. va boshq., 1997; Kuznetsova E.B., Strelnikov V.V., 2006).
MPPP usulining klassik versiyasida radioaktiv yorliqli astarlar bilan PCR ishlatiladi, so'ngra past konsentratsiyali akrilamid bilan denatura qilingan jellarning radioavtografiyasi qo'llaniladi. Ushbu yondashuv zamonaviy laboratoriya sharoitida toksiklikning qabul qilinishi mumkin emasligini, yuqori moddiy va vaqt xarajatlarini, tadqiqotning asossiz mehnat zichligini anglatadi.
MPPP parchalarini ketma-ketligi PCR mahsulotlarini klonlashning mashaqqatli va ko'p bosqichli protsedurasi vositasida amalga oshiriladi, uning jeldan ajratilishi jarayonni bevosita vizual boshqarish imkoniyatisiz sodir bo'ladi. MPFP protokolining ushbu blokini MPFP-ni o'rnatishda ishlatiladigan primerlar bilan to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik bilan almashtirish kerak. Shuningdek, qiziqish fragmentlarini ajratib olish ustidan to'g'ridan-to'g'ri vizual nazoratni ta'minlash kerak, shuningdek jelni tahlil qilish va fragmentlarni aniqlashdan ularni qayta kuchaytirishgacha bo'lgan vaqt oralig'ini qisqartirish kerak, bu butunlikni saqlashga yordam berishi kerak. DNK.
Usulning ishlab chiqilgan optimallashtirilgan versiyasida jeldan ajratib olingan DNK fragmentlarini klonlash tartibi MPPP ni o'rnatish uchun ishlatiladigan primerlardan to'g'ridan-to'g'ri to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik bilan almashtiriladi. Bunday holda, asosiy muammo shundaki, MPPP-da bir nechta turli xil primerlardan foydalanilganda ham, ehtimolligi yuqori bo'lgan amplifikatsiya mahsuloti ulardan bittasi tomonidan yonma-yon joylashtirilishi mumkin. Qaror MPFP-ning barcha mahsulotlarida kamida bitta MspI cheklovini endonukleaza tanib olish saytini o'z ichiga olganligiga asoslanadi, chunki aynan shu xususiyat uchun ular tanlanadi. Ushbu ferment bilan jeldan elitatsiya qilingan parchalarning qayta amplifikatsiya mahsulotlarini gidrolizi turli uzunlikdagi bo'laklarning hosil bo'lishiga olib keladi, ularning ikkitasi primerga homolog ketma-ketliklar bilan yakunlanadi. Ushbu primerdan cheklovlar aralashmasining ketma-ketligi, aksariyat hollarda, kerakli genom mintaqasini aniq aniqlash uchun etarli bo'lgan ma'lumotli nukleotidlar ketma-ketligini olishga olib keladi.
MPFP klassik versiyasining asosiy kamchiliklarini tanqid har bir bosqichda taklif qilingan takomillashtirish bilan taqqoslaganda Jadvalda keltirilgan. bitta.
Jadval 1. Klassik MPFP ning kamchiliklari va usulni optimallashtirish usullari.