Геном днксини ажратиш усуллари

Тадқиқот обектларидан геном ДНК сини ажратиш ва уни электрофорез усули ёрдамида визуализация қилиш

Тадқиқот намуналари сифатида морфобиологик тавсифлари асосида Қашқадарё ғалла майдонларида кенг экиб келинаётган 8 та маҳаллий ва Россия давлати слекционерлари томонидан яратилган қуйидаги навлар танлаб олинди:
1) Кроснодар-99, 2) Қизил шарқ (ўртапишар), 3) Оқ буғдой (лалми), 4) Қизил буғдой, 5) Қизил шалола, 6) Гром, 7) Ғозғон 8) Бухоро чиллаки (лалми нави).
Танлаб олинган ушбу буғдой навлари устида тадқиқотларни олиб бориш мақсадида намуналар Генетика ва ЎЭБ институтига қрашли иссиқхонада Петри ликопчасида 10 кун давомида ўстирилди (4-расм).

4-расм. Тадқиқот намуналарини Петри ликопчасида ундириш.

Униб чиққан ниҳоллардан 2 мл пробиркаларга биологик материаллар йиғиб олинди. Улардан геном ДНК си ажратилгунча пробиркалар т= -20°C ли музлаткичда сақланди. Шундай қилиб, молекуляр тадқиқотларни олиб бориш мақсадида танланган ушбу навларнинг ёш барг тўқималаридан намуналар йиғиб олинди ва улардан СТАВ усулининг маълум даражада ўзгартирилган варианти билан қуйидаги тартиб асосида геном ДНКси ажратилди:

1. 
   Тадқиқот обектлари вегетатсия даврининг 10 – кунида йиғиб олинган барг намуналари чинни ховончаларда суюқ азот ёрдамида гомогенизатсия қилинди. ( бир хил кукунсимон масса ҳосил қилгунча).
   
2. 
   Гомогенизатсия қилинган масса устига 800 µл 2 х СТАБ буффер қўшилди. Ҳосил бўлган аралашма 1,5 мл ҳажмдаги епиндорфларга 800 µл олинди ва 5 дақиқа вортекс қилинди ва 65 C га термостатга 30 дақиқага қўйилди.
   
3. 
   Ҳосил бўлган суюқлик устига 500 µл хлороформ:изоамил спирти (24:1) аралашмаси солиниб, 2 дақиқа яхшилаб аралаштирилди.
   
4. 
   2 дақиқа 8000 айланиш тезлигида центрафуга қилинди ва супернатантнинг юқори қисмидан 750 µл бошқа епиндорфларга олинди.
   

5. Олинган суюқлик устига 75 µл 10хCТАВ солиниб қаттиқ аралаштирилди.
6. Аралашмага яна бир марта 500 µл хлороформ:изоамил спирти (24:1) аралашмаси солиниб, 3 дақиқа яхшилаб аралаштирилди.
7. 2 дақиқа 8 минг айланиш тезлигида центрафуга қилинди ва супернатантнинг юқорисидан 700 µл бошқа епиндорфларга олинди.
8. Аралашма устига 700 µл изопропанол спирти солинди ва 2 дақиқа секин аралаштирилди. 18 соат давомида -20 С давомида қолдирилди.
9. 10 дақиқа 13 800 минг айланиш тезлигида центрифуга қилинди ва супернатант тўкилди.
10. Чўкма устига 400 µл High Salt ТЕ буфери солинди ва 5 дақиқа давомида вортекс ускунасида (чўкма эригунга қадар яхшилаб) аралаштирилди. Сўнг 37 C га термостатга 30 дақиқага қўйилди.
11. Термостатдан олиниб устига 1000 µл 96 % спирт солинди ва секин аралаштирилди. 30 дақиқа давомида -20 С да қолдирилди.
12. 2 дақиқа 10 000 айланиш тезлигида сенрифуга қилинди ва супернатант тўкилди.
13. Чўкма устига 1000 µл 70 % спирт солинди ва 1 дақиқа 10 000 айланиш тезлигида сенрифуга қилинди ва супернатант тўкилди. (Бу босқич 2 марта такрорланди).
14. Чўкма, яъни ДНК 30 дақиқа давомида термостатда 37 С да қуритилди.

15. 
    Чўкма устига 100 µл ТE буфери солиниб вортекс ускунасида аралаштирилди ва қисқацентрифуга (5-6 сония) ва -20ºC ли музлатгичга қўйилди.
    

Геном ДНКсини ажратишдаги баъзи жараёнлари 5-расмда келтирилди.

5-расм. Намуналардан йиғиб олинган барглардан геном ДНКсини ажратиш жараёнлари
Ҳар бир намунадан ажратиб олинган геном ДНКлари 0.9% агароза гелида электрофорез усули ёрдамида текшириб олинди (6-расм). Тадқиқот намуналариинг ажратиб олинган геном ДНКси концентрациялари аниқ концентрацияга эга бўлган λ фаги ДНКсига таққосланиб (визуал тарзда) аниқланди (7-расм). Уларнинг концентрацияси ишчи концентрацияга (25нг/мкл) олиб келинди ва кейинги молекуляр тадқиқотларга қадар музлатилган ҳолда -20°C ҳароратли музлаткичда сақланди.