Mavzu: Molekulyar biologiyaning metodlari Reja

Molekulyar klonlash



Transduktsiya tasviri
Protein funktsiyasini o'rganish uchun molekulyar biologiyaning eng asosiy usullaridan biri bu molekulyar klonlash. Ushbu texnikada, qiziqish oqsili uchun DNK kodlash hisoblanadi klonlangan foydalanish polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) va / yoki cheklash fermentlari ichiga plazmid (ifoda vektori). Vektor uchta o'ziga xos xususiyatga ega: replikatsiya kelib chiqishi, a bir nechta klonlash sayti (MCS) va odatda tanlangan marker antibiotiklarga qarshilik. Ko'p klonlash saytining yuqori qismida joylashgan promouterlik mintaqalari va transkripsiya klonlangan gen ekspressionini tartibga soluvchi boshlang'ich sayt.Bu plazmid bakterial yoki hayvon hujayralariga kiritilishi mumkin. Bakterial hujayralarga DNKni kiritish orqali amalga oshirilishi mumkin transformatsiya yalang'och DNKni olish orqali, konjugatsiya hujayra-hujayra aloqasi orqali yoki transduktsiya virusli vektor orqali. DNKni kiritish ökaryotik hujayralar, masalan, hayvon hujayralari fizik yoki kimyoviy vositalar bilan deyiladi transfektsiya. Kaltsiy fosfat transfektsiyasi kabi bir necha xil transfektsiya texnikasi mavjud. elektroporatsiya, mikroinjeksiyon va lipozoma transfektsiyasi. Plazmid tarkibiga qo'shilishi mumkin genom, natijada barqaror transfektsiya bo'ladi yoki vaqtincha transfektsiya deb ataladigan genomdan mustaqil bo'lib qolishi mumkin.
Qiziqish oqsili uchun DNK kodlashi endi hujayra ichida va oqsil endi ifodalanishi mumkin. Qiziqish oqsilini yuqori darajada ifoda etishga yordam beradigan induktiv promouterlar va hujayralarga xos signal beruvchi omillar kabi turli xil tizimlar mavjud. Keyinchalik ko'p miqdordagi oqsilni bakterial yoki ökaryotik hujayradan ajratib olish mumkin. Oqsilni har xil sharoitda fermentativ faollik uchun sinab ko'rish mumkin, oqsil uning kristallanishi mumkin uchinchi darajali tuzilish o'rganilishi mumkin yoki farmatsevtika sanoatida yangi dorilarning oqsilga qarshi faolligini o'rganish mumkin.^[15]
Polimeraza zanjiri reaktsiyasi
Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) DNKni nusxalash uchun juda ko'p qirrali usuldir. Qisqacha aytganda, PCR ma'lum bir narsaga imkon beradi DNK ketma-ketligi oldindan belgilangan usullar bilan nusxa ko'chirish yoki o'zgartirish. Reaksiya nihoyatda kuchli va mukammal sharoitda bitta DNK molekulasini ikki soatdan kam vaqt ichida 1,07 milliard molekulaga aylantirishi mumkin. PCR texnikasi joriy etish uchun ishlatilishi mumkin cheklash fermentlari saytlari DNK molekulalarining uchlariga yoki DNKning ma'lum asoslarini mutatsiyalashga, ikkinchisi esa bu usul deb ataladi saytga yo'naltirilgan mutagenez. PCR yordamida ma'lum bir DNK fragmenti a da topilganligini aniqlash uchun ham foydalanish mumkin cDNA kutubxonasi. PCR ko'plab farqlarga ega, masalan, teskari transkripsiya PCR (RT-PCR) RNKni kuchaytirish uchun va yaqinda miqdoriy PCR bu DNK yoki RNK molekulalarini miqdoriy o'lchashga imkon beradi.^[16][17]