Termiz davlat universteti tabiiy fanlar fakulteti

2.4. Chip markerlarining ahamiyati.

Birinchi transgenik o'simliklar (mikroorganizmlardan genlar kiritilgan tamaki o'simliklari) 1983 yilda olingan. Zaharli moddalar, alerjenlik, mutagenlik va boshqalar bo'yicha barcha kerakli testlarni topshirgandan so'ng. birinchi transgenli mahsulotlar AQShda 1994 yilda sotilgan. Bular kech pishadigan pomidor va gerbitsidga chidamli soya edi. Hozirgi vaqtda genetik jihatdan modifikatsiyalangan o'simliklarni ishlab chiqarish va sinovdan o'tkazish butun dunyo bo'ylab yuz milliard dollardan ortiq kapitalga ega bo'lgan yuzlab tijorat firmalarida ishlaydi. Genetik jihatdan yaratilgan o'simlik biotexnologiyasi allaqachon oziq-ovqat va boshqa foydali mahsulotlar ishlab chiqarishning muhim tarmog'iga aylangan.

O'simliklar genetik muhandisligi rivojlanishining hozirgi bosqichi "metabolizm muhandisligi" deb nomlanadi. Asosan, buning sababi shundaki, an'anaviy naslchilik singari mavjud o'simlik sifatlarini yaxshilash emas, balki o'simlikni tibbiyotda, kimyoviy ishlab chiqarishda va boshqa sohalarda ishlatiladigan mutlaqo yangi birikmalarni ishlab chiqarishga o'rgatish kerak. Ushbu birikmalar, masalan, maxsus yog 'kislotalari, tarkibida muhim aminokislotalarning ko'p miqdori bo'lgan foydali oqsillar, modifikatsiyalangan polisakkaridlar, qutulish mumkin bo'lgan vaktsinalar, antitellar, interferonlar va boshqa "dorivor" oqsillar, shuningdek atrof-muhitni ifloslantirmaydigan yangi polimerlar bo'lishi mumkin. va boshqa ko'p narsalar.

Genetik muhandislik usullari qishloq xo'jaligi o'simliklarining yangi shakllari, chiziqlari, navlari va duragaylarining turli patogenlarga chidamliligini oshirish va yangi navlarni ko'paytirish muddatini qisqartirish uchun bir qator muhim muammolarni hal qilishga imkon beradi.

O'simliklarning genetik muhandisligi, umuman genetik muhandislik singari, quyidagi asosiy bosqichlardan iborat:

- genlarni tanlash va klonlash;

- qabul qiluvchi o'simlik genotipini tanlash;

- genning kiritilishi va uning retsipient o'simlik genomida ifodalanishi;

- transformatsiyalangan hujayralarni qayta tiklash va transgen o'simliklarni tanlash.

Hayvonlarga nisbatan o'simliklarning muhim afzalligi bitta hujayradan butun o'simlikni olish qobiliyatidir - totipotensiya.

Totipotensiya - bu hujayraning bo'linish orqali organizmning har qanday hujayra turini tug'dirish qobiliyatidir. O'simliklar somatik hujayralarining o'ziga xos xususiyati kattalar o'simliklari va urug'lari paydo bo'lishigacha ma'lum o'sish sharoitida ontogenetik rivojlanishning irsiy dasturini to'liq amalga oshirishdir.

Transgen o'simliklar olishning asosiy muammolaridan biri begona genlarni o'simlik xromosomalariga kiritish usuli, ya'ni. o'simlik hujayralarining o'zgarishi.

O'simliklar hujayrasiga kiritilgan genetik konstruktsiyaga odatda quyidagilar kiradi: oqsillarni kodlovchi tizimli ketma-ketlik, tarjima va transkripsiyaning signal beruvchi elementlari, shuningdek marker genlari.

Chet el DNKini o'simliklarga kiritishning turli usullari mavjud. Ikki qavatli o'simliklar uchun gorizontal genlarni uzatish uchun tabiiy vektor - agrobakterial plazmidlar mavjud. Monokotlarga kelsak, so'nggi yillarda ularni agrobakterial vektorlar bilan almashtirishda ma'lum yutuqlarga erishilgan bo'lsa ham, bunday o'zgarish yo'li hali ham katta qiyinchiliklarga duch kelmoqda.

Agrobakteriyalar bilan o'simliklarning o'zgarishi

Ma'lumki, tuproq bakteriyalarining ayrim turlari (Ag-robakteriyalar) ikki pog'onali o'simliklarga zarar etkazishi va o'ziga xos shish paydo bo'lishiga sabab bo'lishi mumkin. Shish hujayralari o'simlik uchun odatiy bo'lmagan aminokislotalarni sintez qiladi - azot va uglerod manbai sifatida agrobakteriyalar tomonidan ishlatiladigan opinlar (arginin hosilalari). Shunday qilib, o'simliklar agrobakteriyalar bilan kasallanganda, o'zgargan o'simlik hujayralarining metabolizmi qayta tiklanadi va ular faqat bakteriyalar uchun zarur bo'lgan birikmalarni sintez qila boshlaydi.

Transformatsiya jarayonida o'simlikning hujayra devori bakteriyalarning pektolitik fermentlari ta'sirida zararlanadi va bakteriyalarning o'simlik hujayrasi plazmalemmasi bilan yaqin aloqasi ta'minlanadi. Ushbu aloqa natijasida bakterial DNK o'simlik hujayrasiga ko'chiriladi.

Eng ko'p o'rganilgan va keng qo'llaniladigan agrobakteriyalarning 2 turi. Birinchisi - Agrobacterium tumefacienes, ikkinchisi - Agrobacterium rhizogenes.

A. tumefaciens o'simliklarda "toj pufagi" tipidagi o'smalar hosil bo'lishiga turtki beradi, bu ularning bir qismi o'simlik hujayralari xromosomalariga kiritilgan Ti-plazmid (o'sma induktsiyasi) mavjudligi bilan bog'liq.

Anjir. 22. T-DNKning o'simliklarning xromosomasiga qo'shilishi va o'smaning hosil bo'lishi (ES Piruzyan bo'yicha) (toj pufagi).

A. rizogenes - "bor ildizi" deb nomlangan kasallikni keltirib chiqaradi, unda ildizning zararlanish zonasida yangi ildizlarning massasi hosil bo'ladi va bu hodisa Ri plazmidiga (ildizni induktsiya qilish) bog'liqdir.

Agrobakterium plazmidlari tuzilishi to'g'risida batafsil ma'lumot ularni cheklash yoki fizik xaritada olish yo'li bilan olingan. Plazmidlar - uzunligi 200 Kb bo'lgan Dumaloq DNK molekulalari. Bakterial hujayralarda ular avtonom tarzda ko'paytirilishi mumkin.

Transformatsiya mexanizmini o'rganish natijasida na Agrobacterium, na plazmidning o'zi o'simlik hujayrasiga kirishi aniqlandi. Plazmidning faqat T-DNK (o'zgaruvchan DNK) deb ataladigan qismi hujayraga ko'chirilib, genomga kiritiladi. Uzunligi - taxminan 23 tp. T-DNKdan tashqari plazmidlarda konjugatsiya funktsiyasini (Tra), replikatsiya mintaqasini (OriV) va virulentlikni (Vir) kodlovchi mintaqa mavjud. T-DNK yonidagi Ti-plazmid sekanslari (chegara yoki terminal mintaqalar) o'simlik genomiga integratsiyalashishda muhim rol o'ynaydi va 24-25 bp takroriylikni o'z ichiga oladi.

Anjir. 23. Ti-plazmidlarning tuzilishi.

T-DNKning o'tkazilishidagi terminal mintaqaning muhim rolini hisobga olgan holda, ushbu uchlar orasiga kiritilgan har qanday DNK segmentini T-DNKning bir qismi sifatida o'simliklarga ko'chirish mumkin deb taxmin qilish mumkin. Plazmidlar barcha onkogen ketma-ketliklarni olib tashlaydigan va ularning o'rniga begona DNKni qo'shadigan tarzda o'zgartiriladi. Natijada, plazmid onkogen xususiyatlarini yo'qotadi, qayta tiklanadigan o'simliklarda mavjud bo'lgan onkogen bo'lmagan T-DNK Mendel qonunlari bo'yicha ko'chiriladi.

Kerakli genni o'z ichiga olgan Ti-plazmid sekanslarini o'simlikka kiritish uchun ikkita usul ishlab chiqilgan.

Birinchi usul, "oraliq vektorlar" usuli (ko-integral integral vektorlar), Escherichia coli plazmidining pBR 322 dan foydalanishga asoslangan. T-DNK Ti plazmididan restrakt fermentlari yordamida chiqarib tashlanadi va pBR 322 plazmidiga kiritiladi. E. coli ichiga klonlash uchun. Istalgan gen restriksiyon fermentlari yordamida klonlangan T-DNKga kiritiladi, natijada hosil bo'lgan rekombinant molekula yana ko'p miqdorda ko'paytiriladi, ya'ni E. coli-da klonlanadi. Keyin konjugatsiya yordamida ular to'liq Ti-plazmidni tashiydigan Agrobakterium hujayralariga kiritiladi.

Ikkinchi usul ikkilik (juft) vektorlar tizimini yaratishga asoslangan. Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, infektsiya va transformatsiya uchun butun bir Ti-plazmid kerak emas, lekin faqat T-DNKning chegara hududlari va Ti-plazmidning virulentlik uchun mas'ul bo'lgan bitta mintaqasi etarli. Bundan tashqari, ushbu ikkita DNK mintaqasi bir plazmidda bo'lishi shart emas. Agar Agrobakterium hujayralarida virus segmenti bo'lgan Ti-plazmid va T-DNK bilan boshqa plazmid bo'lsa, bu bakteriyalar o'simlik hujayralarini o'zgartirishi mumkin. Bunda T-DNK tarkibiga kiritilgan har qanday genlar bilan o'simlik genomi bilan birlashadi; bu bakteriyalar hujayralarida gomologik rekombinatsiyani talab qilmaydi.

O'simliklarning o'zgarishi uchun DNK tarkibidagi viruslarga asoslangan vektorlar ham keng qo'llaniladi. Eng istiqbolli oq karam mozaikasi virusidir, bu asosan karam oilasining o'simliklarini yuqtiradi. Virionning diametri taxminan 50 nm, uzunligi 8000 nm bo'lgan dumaloq DNKni o'z ichiga oladi. Genomning kichkina kattaligi virusli DNKni in vitro ravishda bakterial plazmid sifatida boshqarishga imkon beradi va keyin uni barglarga surtish orqali o'simliklarga kiritadi; virus tez ko'payadi va hujayradan hujayraga yuqadi.

Viruslarga asoslangan vektorli tizimlarning afzalligi genomning kichikligi, o'simlik hujayralarida virusli DNKning yuqori kontsentratsiyasi (har bir hujayra uchun 50000 tagacha) va begona genlarning samarali ekspressionini ta'minlaydigan kuchli promotorlarning mavjudligi.

Anjir. 24. Transgen o'simliklarni olish sxemasi: a) bioballistik usul bilan, b) Agrobacterium bilan birgalikda etishtirish.

Agrobakteriyalarga chidamli o'simliklarning o'zgarishi uchun DNKning hujayraga to'g'ridan-to'g'ri jismoniy o'tishi usullari ishlab chiqilgan bo'lib, ularning ko'pchiligi bakterial yoki hayvon hujayralari bilan ishlash amaliyotidan olingan. Ushbu usullar juda xilma-xildir, ularga quyidagilar kiradi: mikropartikulalarni bombardimon qilish yoki ballistik usul; elektroporatsiya; polietilen glikol bilan qayta ishlash; Lipozomalar ichida DNKning tarqalishi va boshqalar.

Eng samarali va eng ko'p ishlatiladigan usul bu mikropartikulalarni bombardimon qilish usuli. Etarli tezlikda bu zarralar to'g'ridan-to'g'ri yadroga kirib borishi mumkin, bu transformatsiya samaradorligini sezilarli darajada oshiradi. Biroq, xuddi shu usul yordamida DNK o'z ichiga olgan boshqa hujayra organoidlarini - xloroplastlar va mitoxondriyalarni konvertatsiya qilishda foydalanish mumkin.

Yaqinda agrolistik deb nomlangan birlashgan transformatsiya usuli ham muvaffaqiyatli qo'llanilmoqda. Bunday holda, begona DNK to'qimalarga ba'zi fizik usul bilan kiritiladi, masalan, ballistik. Kiritilgan DNK tarkibiga T-DNK, maqsad va marker geni bo'lgan vektor va shuningdek, ökaryotik promotor ostida joylashtirilgan agrobakterial virulentlik genlari kiradi. O'simliklar hujayrasida virulentlik genlarining vaqtincha ifodalanishi an'anaviy agrobakterial transformatsiyadagi kabi plazmiddan T-DNKni to'g'ri ajratib olishga va xost genomiga kiritishga imkon beradigan oqsillarni sinteziga olib keladi.

O'simliklar to'qimalarining konvertatsiyasini u yoki bu usul bilan amalga oshirgandan so'ng, u vitroda fitoxormonlar bo'lgan maxsus muhitga joylashtiriladi, bu hujayralar ko'payishiga yordam beradi. O'rtacha vosita odatda selektiv vositani o'z ichiga oladi, unga qarshi transgen, ammo boshqarilmaydigan hujayralar chidamli bo'ladi. Rejeneratsiya ko'pincha kallus bosqichidan o'tadi, shundan so'ng vositalarni to'g'ri tanlash bilan organogenez (o'q hosil bo'lishi) boshlanadi. Yaratilgan kurtaklar ildiz otadigan muhitga o'tkaziladi, ko'pincha transgenik shaxslarni yanada qattiqroq tanlash uchun selektiv vositani o'z ichiga oladi.

So'nggi yillarda olimlar transgenli o'simliklarni "antisens RNK" (teskari yoki antisens RNK) hosil qilishda yangi yondashuvdan foydalanmoqdalar, bu sizni qiziqtirgan genning ishini boshqarishga imkon beradi. Bunday holda, vektorni qurishda, kiritilgan genning DNK nusxasi (c-DNK) 180 ° ga buriladi. Natijada transgenli o’simlikda normal mRNK molekulasi va teskari molekula hosil bo’ladi, u normal mRNKning komplementarligi tufayli u bilan kompleks hosil qiladi va kodlangan oqsil sintez qilinmaydi.

Ushbu usul meva sifati yaxshilangan transgen pomidor o'simliklarini olish uchun ishlatilgan. Vektor tarkibiga o'simlik to'qimalari hujayralararo makonining asosiy komponenti bo'lgan pektinni yo'q qilishda ishtirok etadigan ferment - polihalakturonaza sintezini boshqaradigan PG genining cDNKsi kiritildi. PG geni mahsuloti pomidor mevalarining pishib etish davrida sintezlanadi va uning ko'payishi pomidorlarning yumshoq bo'lishiga olib keladi va bu ularning yaroqlilik muddatini sezilarli darajada pasaytiradi. Transgenlarda ushbu genning ishdan chiqarilishi yangi mevali xususiyatlarga ega bo'lgan pomidor o'simliklarini olishga imkon berdi, ular nafaqat uzoq vaqt omon qolishdi, balki o'simliklarning o'zi ham qo'ziqorin kasalliklariga chidamli edi.

Antisense konstruktsiyalar strategiyasi gen ekspressionini o'zgartirish uchun keng qo'llaniladi. Ushbu strategiya nafaqat yangi fazilatlarga ega o'simliklarni olish uchun, balki o'simliklar genetikasi bo'yicha fundamental tadqiqotlar uchun ham qo'llaniladi.

Xulosa

    Uzoq muddatli ilmiy tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, DNK markerlari genotiplarni sertifikatlash, populyatsiyaning polimorfizmini baholash, genetik xaritalash, filogenetik tadqiqotlar, kasalliklar diagnostikasi va boshqalar bilan bog'liq muammolarni hal qilishda eng samarali hisoblanadi.

Mavjud DNK markerlarining har xil turlari orasida quyidagi molekulyar tahlil usullari keng qo'llanilgan: RAPD, RFLP, CAPS, AFLP, ISSR, SSR, SNPs, DArT, ular oqsil (morfologik va sitogenetik) markerlarini almashtirdilar, chunki ular isbotlangan. kengaytirilgan piksellar sonini, tezligi, soddaligi va qulayligi jihatidan yanada ilg'or bo'ling.

Shunday qilib, biz xulosa qilishimiz mumkinki, yuqoridagi DNK markerlaridan mikrosatellitlar (SSR markerlari), mikrosatellitlar ketma-ketligi (ISSR markerlari) va DNK mikrosxemalari (SNPs va DArT) asosidagi markerlar hozirgi kunda eng istiqbolli hisoblanadi va ularning yuqori narxiga qaramay, ular ko'proq Yuqori ma'lumot mazmuni, ishonchliligi, takrorlanuvchanligi, tahlilni to'liq avtomatlashtirish imkoniyati tufayli ular genomik tanlov va barcha tirik organizmlarning genetik xilma-xilligini tadqiq qilish uchun javob beradi.

 Eukaryotik genomning o'ziga xos xususiyati bu DNKning ko'payishi bo'lib, uning miqdori barcha hujayra oqsillarining tuzilishini kodlash uchun zarur bo'lgan miqdordan oshib ketadi. Ko'paytirishning sabablaridan biri takroriy nukleotidlarning mavjudligi. Eukaryotlardagi genlarning eksperimentini boshqarishning asosiy qismi bitta xromosoma darajasida bo'ladi. Eukaryotlarda genlarning ifoda etilishi qisman har bir xromosomada DNKni bo'shatish va bo'shatish bilan bog'liq. Eukaryotik DNK xiston deb nomlangan mayda ixtisoslashgan oqsillarga o'ralgan xromatin tolalari shaklida tashkil topgan. Mitoz yoki meiozdan oldin, DNK va histonlar bir-biriga buralib, biz xromosoma deb tan olgan tuzilmalarni hosil qiladi. Eukaryotik genda, targ'ibotchining orqasida ikki xil segment mavjud: intron va ekson. Intronlar (IN-trahnz) - bu strukturalangan genning transkripsiya qilingan, ammo tarjima qilinmagan hududlari. Exons (EK-sahnz) - bu struktura genining ifodalangan va transkripsiya qilingan mintaqalari. Ammo yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, kodlanmagan RNK intronlardan translyatsiya qilingan bo'lsa ham, muhim funktsiyalarni bajaradi. Ushbu funktsiyalarning ba'zilariga translyatsion RNKni tartibga solish, genlarning ifoda etilishiga ta'sir qiluvchi ushbu kodlovchi RNK bilan o'zaro ta'sir qilish va ma'lum bir kimyoviy maqsadlar mavjud bo'lganda oqsil ishlab chiqarilishini ta'minlaydigan "kalitlar" vazifasi kiradi.

      Bakterial genomlarning tarkibiga mustaqil genlar va operonlar kiradi. Mustaqil genlarning ishi boshqa genlar tomonidan tartibga solinmaydi va ularning ifodasi tabiatda konstitutsiyaviy (uzluksiz). Mustaqil genlar qo'shni genlardan kodlanmagan mintaqalar (spacers) tomonidan ajratilgan, ular odatda transkripsiya qilinmaydi. Mustaqil genlardan farqli o'laroq, operon umumiy tartibga solish tizimiga ega bo'lgan, qo'shni genlar guruhidir. Odatda, bu genlar biokimyoviy jarayonning ketma-ket bosqichlarida qatnashadilar. Operonni tartibga solish tizimi promouter, operator va gen-regulyatorni o'z ichiga oladi.